Construcción de una genoteca genómica de larvas de tercer estadio avanzado (L3A) de Gnathostoma sp

Propiedades

Título

Construcción de una genoteca genómica de larvas de tercer estadio avanzado (L3A) de Gnathostoma sp

Autor

Sabino Pacheco Guillén

Director de Tesis

Ma. de Jesús Duran Avelar, Norberto Vivanco Pérez

Palabras clave

Ingeniería genética -- Tesis y disertaciones académicas Clonación -- Larva -- Tesis y disertaciones académicas

Fecha de titulación

2003

Editorial

Universidad Autónoma de Nayarit

Resumen

El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo construir una genoteca genómica a partir de larvas de tercer estadio avanzado (L3A) del nemátodo Gnathostoma sp., aisladas de peces comercializados en la ciudad de Tepic, Nayarit, utilizando el bacteriófago de sustitución EMBL3 como vector de clonación, previa determinación de la especie del parásito. La importancia del estudio radica en que la gnathostomosis humana (causante del síndrome de larva migrans) se ha convertido en un problema relevante de salud pública en la región, requiriéndose herramientas moleculares para explorar y caracterizar genes involucrados en los mecanismos de patogenicidad, diagnóstico y tratamiento de esta parasitosis. La metodología experimental se desarrolló en el Laboratorio de Biología Molecular del Centro Multidisciplinario de Investigación Científica (CEMIC) de la Universidad Autónoma de Nayarit. Se aislaron larvas L3A a partir del músculo esquelético del pez Cathorops fuerthii ("chihuil") y se realizó la extracción de ADN genómico (gADN) a partir de 500 larvas. Para identificar la especie, se amplificaron por PCR las regiones ribosomales espaciadoras transcritas internas (ITS-1 e ITS-2) y se secuenció el fragmento de ITS-2 (595 pb totales, 421 pb de ITS-2 propio), alineándolo con secuencias depositadas en bases de datos moleculares. Para la construcción de la genoteca, el gADN fue sometido a digestión parcial a gran escala con la endonucleasa Sau 3AI (0.54 U) para generar fragmentos en el rango de 9 a 23 Kb. Estos fragmentos fueron ligados al vector EMBL3 digerido con Bam HI y desfosforilado. El ADN recombinante se empaquetó in vitro utilizando extractos proteínicos virales y se propagó en células competentes de Escherichia coli de la cepa LE392. Los resultados de la secuenciación de la región ITS-2 mostraron una identidad del 100% con la especie Gnathostoma binucleatum. La genoteca genómica amplificada se constituyó con un total de 30,500 recombinantes independientes con insertos de 9 a 23 Kb, lo que representa un equivalente genómico (GE) de 5.7 y otorga una probabilidad del 99% de encontrar cualquier secuencia de interés dentro del genoma de G. binucleatum. La evaluación del ADN recombinante mediante análisis de restricción con Sal I en 15 clonas tomadas al azar confirmó la inserción exitosa de fragmentos de gADN en el vector. Se concluye que se logró la identificación precisa de la especie prevalente en Nayarit (G. binucleatum) y la generación de la primera genoteca genómica de este helminto, constituyendo una herramienta genómica básica para la caracterización de genes e investigaciones biomédicas futuras.

Programa educativo

Químico Farmacobiólogo