Estandarización de métodos moleculares para la identificación de la mutación T>C 1843 del gen de halotano

Propiedades

Título

Estandarización de métodos moleculares para la identificación de la mutación T>C 1843 del gen de halotano

Autor

Mónica Rodríguez Jiménez

Palabras clave

Genética animal Cria de cerdos

Fecha de titulación

2004

Editorial

Universidad Autónoma de Nayarit

Resumen

Objetivo del Estudio: Estandarizar métodos de diagnóstico molecular a nivel de ADN para determinar la presencia de la mutación T>C1843 en el gen del Halotano (asociado al Síndrome de Estrés Porcino).
Metodología y Obtención de Muestras:
Se utilizaron 15 muestras de sangre periférica (5 por cada genotipo: homocigotos normales, heterocigotos portadores y homocigotos positivos) recolectadas con EDTA.
El ADN se purificó mediante el protocolo estandarizado de la técnica fenólica.
Condiciones de la PCR:
Se evaluaron cuatro juegos de primers y un gradiente de temperatura de alineación de 62°C a 67°C.
El juego de primers 5-R2 demostró la mejor amplificación a una temperatura óptima de 67°C, generando un fragmento de 415 pb. Los primers 1-2, 3-2 y 5-2 presentaron deficiencias debido a un diseño con temperaturas teóricas elevadas.
Métodos de Diagnóstico Evaluados:
Primer método (RFLP con enzima HhaI): Al digerir el producto amplificado con 5-R2, se identificó al homocigoto normal (fragmentos de 330 pb y 85 pb), al homocigoto mutante (415 pb) y al heterocigoto (tres fragmentos: 415, 330 y 85 pb).
Segundo método (RFLP con enzima BsiHKAI): Permitió diferenciar los genotipos tras la digestión del fragmento 5-R2, mostrando patrones claros para homocigotos mutantes (330 pb y 85 pb), normales (415 pb) y heterocigotos (los tres fragmentos).
Tercer método (MS-PCR): No logró diferenciar adecuadamente los fragmentos relacionados con los genotipos evaluados.
Conclusiones Principales:
Es fundamental estandarizar las metodologías y realizar un diseño adecuado de los primers antes de su implementación en el laboratorio.
Una amplificación exitosa por PCR simplifica notablemente el posterior análisis por RFLP.
Se destaca la importancia de utilizar reactivos de alta calidad independientemente de su costo para asegurar la fiabilidad de los resultados.